1.植物基因工程方面
(1)建立了一整套基因转化技术和取得了一批转基因植物。自1986年以来,植物基因工程实验室已成功地分别将来自病毒、细菌、动物、人类和异源植物的共30种外源基因成功地转化入植物基因组,共获得18种转基因植物,并得到传代和表达。其中在国内外首次获得的转基因植物有籼稻等重要经济作物。
(2)近5年来对农作物改良的多基因策略设想进行了实施,并获得了重要的研究结果。以具有实用意义的籼稻品种七丝软占、特青、竹籼B、穗优占等和粳稻品种中花八号等的胚性愈伤组织为外源基因的受体,应用基因枪法或农杆菌法,通过单或共转化将2-7个基因导入上述水稻品种, 对转基因当代及其后代(T0~T5代)进行Southern blot、Northern blot 或Western blot等分子生物学鉴定和遗传学分析, 并进行了抗病或抗虫试验。从大量的转基因后代群体中可选出外源基因整合稳定、表达强且表现出较强的抗病抗虫能力的一批株系。已初步证明转多个基因可扩大抗谱、提高抗性。如应用多个抗性相关基因,可抗多个稻瘟病的生理小种包括强感染能力的生理小种,同时还表现出抗纹枯病的能力等。另外很可能可延长抗性品种的应用年限。
(3)在植物基因工程方面,经过多年艰苦努力,实验室已获得多项已推广应用或具有应用的前景的成果。
①已培育出高抗稻瘟病转基因水稻品系2个,获得国家基因工程安全委员会批准,已完成中间试验,将申报环境释放。培育出高抗褐飞虱、稻纵卷叶螟转基因水稻品系各1个,已申报中间试验。
②应用自己克隆的PRV的CP和RP基因导入木瓜优良品种,已成功地获得对这种病毒病免疫的几个品系。如果这一品种得到推广将会使华南地区的木瓜业重振过去的兴旺状况。这一成果已经田波院士为首的专家组的严格鉴定,认为已经成功,其研究水平为国际先进,部分国际领先。
③与广东省农科院合作,在80年代中、后期研究"黑优粘"成功的基础上,经过进一步改良,获"黑优粘"系列新品种,产生了巨大的经济和社会效益。
2.医药生物技术和基因工程研究与开发应用成果
(1)创新药用功能基因的筛选和开发
①新发现的两枚血小板生成素受体(TPOR)配体蛋白(Ligand)治疗血小板减少症的新型生物工程药物。本实验室用酵母双杂交系统和生物感应仪(Biosensor)从人体cDNA基因库中发现血小板生成素受体(TPOR)的两枚新配体(ligands)。这是世界上首次发现除TPO之外,人体内尚存在TPOR的其它配体。这项发现不仅对研究TPO和TPOR的功能具有重要的理论意义,其研究结果还将对理解受体与配体间相互作用的分子机理、以及信号传导机制等产生新的认识,同时也将为开发治疗血小板减少症的新型药品开拓新的途径,因而具有广阔的应用前景。
②在"国家海洋863高科技攻关项目"的支持下,借助于功能基因表达克隆和生物信息学的分析方法对海蛇毒素功能基因进行了系统的研究与分析,获得38个具有药用价值的海蛇毒素新功能基因。另外通过承担国家医药创新博士基金项目"抗肿瘤新药筛选模型的建立与应用",以及广州市科委重点攻关项目"生物技术在新药筛选中的应用",成功建立了具有国际先进水平的抗肿瘤和抗炎症新药功能基因快速筛选模型。在该项目的研究中,利用这些模型对海洋生物活性蛋白/多肽新功能基因进行功能筛选,鉴定其功能,寻找有治疗意义的新基因。同时在"国家863高科技攻关项目"的支持下,借助于以上快速筛选模型以及生物信息学的分析方法对海洋生物毒素进行了系统的研究与分析,并对其生物学功能,结构规律,基因表达与分布,药用活性等进行了系统研究,为进一步研究开发出相关的海洋基因工程药物提供了很好的技术基础。
(2)现有基因工程药物的改进
①新的有效抑癌基因工程药物--血管生长抑制素及内皮细胞抑制素的基因工程研究。现已完成血管生成抑制素和内皮细胞抑制素基因的克隆和序列分析,大肠杆菌和酵母工程菌的构建,血管生成抑制素和内皮细胞抑制素的表达,纯化并测定了这两种基因工程药物的生物活性,证明它能强烈抑制黑色素瘤,人鼻咽癌的生长,并已申请国家专利两项。
②第三代溶栓基因工程药物---新型重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的研制应用蛋白质结构原理,定点突变t-PA基因,研制半衰期更长的特异性更强的新型rt-PA(第三代溶栓药物)。现在已克隆到人t-PA cDNA并在E. coli中获得表达,我们已将该cDNA进行了7个位点突变,改进了t-PA体内半衰期短等缺点,已在昆虫细胞中进行高效表达试验,其表达量已明显超过了文献中其他真核表达系统的最高表达量。
(3)分子生物学技术与基因工程在中药现代化中的应用
①灵芝的生物技术研究和该成果的应用推广情况。通过基因工程改良灵芝菌种,分别推出"汇中一号"和"灵健二号"新菌种,发展了10吨罐和18吨罐的发酵生产技术和工艺,大大提高了灵芝的产量和质量,现已分别由上海市中祥生物高科技公司和中山市中草堂公司生产,其产品在中、外推销均反应良好。以上研究已申请了三项专利和获得一项奖励。
②已建立了中药材真伪基因鉴定技术,开展了不同药效灵芝的种质鉴别以及人参等名贵药材不同产地的道地性分子标准研究,尤其是在寄生真菌药材--冬虫夏草基因鉴别方面已取得较大进展。此外在杜仲、溪黄草等中药材原植物混淆品种鉴别也取得了一系列的成果。
3.分子生物学基础研究成果
(1)真核生物核糖体合成中的基因表达及调控方面的进展
①在RNA新基因的发现与鉴定的方法学上取得了突破。根据snoRNA的结构和生物学特点建立了一种RNA基因识别的新方法,发现40余种新的snoRNA基因(其中包括10余种人类snoRNA新基因)。
②在国际上首次报道了水稻Hsp70基因中存在的一个内含子中编码多个snoRNA的新结构,提示了植物snoRNA基因组织的多样性。同时在模式植物拟南芥中发现11个snoRNA基因簇,研究论文已被国际分子生物学权威杂志《核酸研究》接受发表(SCI 影响因子为5.7)。
③在酿酒酵母 13 号染色体上一个新的snoRNA基因簇的鉴定及其表达和功能的研究中取得重要进展。在国际上首次发现和鉴定由7个新的snoRNA基因组成的snoRNA基因簇及其功能;并揭示了该基因簇表达的新机制。研究论文已发表在国际细胞分子生物学权威杂志《分子细胞生物学》.杂志上(SCI 影响因子为10.7)。
以上研究成果,是我国在RNA新基因的发现及其功能鉴定这一科学领域中的创新性成果。
(2)生物物种资源与技术
①开展以Ls-rRNA序列分析为基础的生物分子系统演化研究。在藻类起源,原生生物的分子系统,高等植物分子系统演化以及东亚北美间断分布植物类群分子系统及地理学等方面取得重要成果。根据rRNA结构进化的特点和规律,进一步提出rRNA探针群和生物分子分类检索表的概念,为建立生物高级阶元和生物物种界定分子标准作了开拓性探讨,并为rRNA基因分析技术在生物资源与环境保护中的应用奠定坚实的基础。
②将rRNA基因分析技术应用于生物资源与环境的研究。对我国南海有害赤潮原因种的rRNA基因分析,建立起了一种适合于微藻类单个细胞的DNA分析方法,为许多难于培养的藻类的分子研究开辟了道路。 在此基础上首次揭示我国南海赤潮有毒甲藻的分子地理标记,并在微藻物种分子鉴别的理论与方法等方面取得重要进展。这些进展为进一步建立起对海洋自然水体中赤潮种源的快速鉴定方法以及赤潮监控与预报的分子生物学关键技术奠定基础。此外,在我国特有动植物如银杏,新疆北鲵的分子特征及进化,中药材原植物的分子鉴定以及灵芝,虫草等名贵药材的基因分析等方面取得一系列新的成果,及申请了病原沙门氏菌核酸探针等3项专利。
(3)植物抗病的分子机理和发育的分子生物学及生物钟的研究
①植物抗病的分子机理研究。已从大麦基因库成功获得包括启动子在内的GII基因,并已确定整个基因的DNA序列,这对开展大麦抗真菌蛋白质启动子的研究并进而上溯发掘与GII 启动子结合之诸反式作用因子,及因真菌感染或其他环境因素所引致的信息传递过程的其他成员已成可能。另外,与美国的实验室合作,在植物的诱导后天性的植物分子生物学的机理研究方面,如水杨酸在诱导马铃薯获得抗病性中的信号传导分子作用的研究等,也取得较系统的国际先进水平的研究成果。
②以水稻S5 座位表现的杂交亲和性遗传效应为基础,建立了一套完整的图位基因克隆工作系统,包括构建特定广亲和品种的YAC文库,用RFLP标记对广亲和基因进行分子定位以及通过构建YAC/BAC重叠群进行染色体步查,为最终克隆广亲和基因奠定了较好基础,在研究中还发展了一种图位选择cDNA克隆的方法,获得一批cDNA克隆,并测定其序列而有效地转化为图位已知的EST。 此外,为了将工作进一步扩展到水稻营养器官发育问题,正在进行突变工作,获得一些影响营养器官发育的突变体,试图将这方面的研究和超级稻培育的分子基础研究相接。
③证明在重复DNA顺序中,存在丰富的调节元件,如启动子、增强子、USE序列、polyA信号,它们可能在系统发育和个体发育中具有功能意义;.发现一个编码水稻叶绿体光系统IQB蛋白基因的同源序列存在于水稻核DNA重复序列中,而且这个序列日于育其保守的3端和变异5端,可以观察到从光台细菌到单子叶植物进化四个明显跃变阶梯,这些研究对真核重复DNA的生物学功能意义加深了认识。
④成功地进行了粗糙脉孢霉生物钟基因的定位克隆。运用亲缘选择法克隆了arg-13,以arg-13为起点,成功地进行了定向染色体步移,克隆了os-1基因,将钟基因prd-4遗传定位在arg-13和os-1之间。来自于一个粘粒(含有 arg-13和部分os-1基因)的5kb BamH I片断被用于RIP(重复诱导的点突变,指转化产生的重复在有性生殖时会发生突变、重排),产生了无节律的突变株。我们最近测得5kb BamH I 片断的基因组序列,查询粗糙脉孢霉基因组计划的表达顺序标签数据库(EST Database),找到一个长1.1kb cDNA。预测编码一个含164个氨基酸的蛋白质。其编码的蛋白质与酵母无机焦磷酸酶的一个区域有高同源性。
(4)生物信息学研究基础与进展
实验室现已与法国巴斯德研究所合作建立共用的生物信息网址,共享双方的生物信息数据和软件。同时,还跟美国生物信息公司D'Trends Inc(由Bioinformatics的命名者H.A. Lim博士创建的,Lim博士现为联合国特聘的生物信息专家;美国NIH的生物信息学顾问专家)签定合约,以共同开发出具有价值的生物信息分析工具和模拟演示系统,以供研究生命系统的本质和生物分子的规律。
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