名称:      猫杯状病毒感染性克隆及其构建方法和应用

申请（专利）号:       CN201210004855.2     申请日:       2012.01.06

授权（公告）号:       CN102559757B     授权（公告）日:       2013.07.31

申请（专利权）人:       广东省农业科学院兽医研究所

地址:       510640 广东省广州市天河区五山路白石岗

发明（设计）人:       向华;徐敏;黄元;陈晶


摘要:

本发明公开了猫杯状病毒感染性克隆，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到。实验结果表明，使用本发明克隆生产得到的FCV，与亲本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使细胞明显变性，滴度高，传代稳定。     

主权项:

猫杯状病毒感染性克隆的构建方法，通过在FCV病毒的全长cDNA的两端连接酶切位点，之后将序列连接到表达载体中得到，所述表达载体为去除了f1、 ori 、SV40、 neo和plyA序列的商品化质粒pcDNA3，表达载体的3’端连接有自剪切型核酶；其构建方法包括以下步骤：1)  使用PCR法扩增FCV全长cDNA，并在两端引入酶切位点，得到FCV全长基因组；2)  将商品化质粒pcDNA3的f1、 ori 、SV40、 neo和plyA序列去除，得到改造质粒，命名为pCDNA；3)  在改造质粒pCDNA的3’端引入核酶序列，得到的产物命名为pCDNA‑HDRZ；4)  将克隆出FCV全长基因组与pCDNA‑HDRZ相连接，得到猫杯状病毒感染性克隆；其中，引入核酶序列时包括如下步骤：1)  以pCDNA为模板，以DNA3HDRZ1和DNA3B为引物，进行PCR，PCR程序是：95℃ 5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到PCR产物pHDRZ1；2)  以pHDRZ1为模板，以DNA3HDRZ2和DNA3B为引物，PCR程序是：95℃ 5min；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到的PCR产物命名为pHDRZ2；3)  以pHDRZ2为模板，以DNA3HDRZ3和DNA3B为引物，PCR程序是：95℃ 5min；98℃10s，59℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min，得到的PCR产物命名为pCDNA‑HDRZ；4)  胶回收pCDNA‑HDRZ连接pMD18‑T载体，转化，得到改造载体；其中，引物的序列为：DNA3HDRZ1：5′‑GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC 3′；（SEQ ID NO：1）DNA3HDRZ2：5′‑TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTC CACTCG‑3′；（SEQ ID NO：2）DNA3HDRZ3：5′‑ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC‑3′（SEQ ID NO：3）DNA3B：5′‑ TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC‑3′（SEQ ID NO：4）。